Limfocyty to rodzaj białych krwinek, które pomagają naszemu organizmowi w walce z infekcjami i chorobami. Możemy wyróżnić dwa rodzaje limfocytów: limfocyty B i limfocyty T, które mimo że działają razem, mają różne role w układzie odpornościowym. Limfocyty B powstają ze szpiku kostnego i są odpowiedzialne za produkcję małych białek (przeciwciał), które są skierowane przeciwko wirusom i bakteriom, blokującym je przed zakażeniem zdrowych komórek. Limfocyty T również powstają w szpiku kostnym, ale w przeciwieństwie do limfocytów B, dojrzewają w grasicy. Każdy limfocyt T na swojej powierzchni nosi receptor (T- cell receptor w skrócie TCR), który może rozpoznawać konkretne obce cząsteczki nazywane antygenami. Jeśli limfocyt T rozpozna antygen, który wiąże się z jego receptorem TCR, wywoła to jego aktywację, co skutkuje wydzielaniem różnych białek, które mogą indukować stan zapalny, a w konsekwencji nawet śmierć komórki. Limfocyty T, które rozpoznają antygeny naszych komórek, zazwyczaj giną podczas dojrzewania w grasicy, dlatego limfocyty T zwykle rozpoznają i zabijają tylko obce lub zainfekowane komórki. Komórki nowotworowe mają na powierzchni antygeny, które są rozpoznawane przez limfocyty T jako „własne” i nie wywołują reakcji immunologicznej [1].

Różne warianty immunoterapii opartej na limfocytach T

Pomysł wykorzystania układu odpornościowego do zwalczania raka można datować na koniec XIX wieku, kiedy William Coley zauważył spontaniczną regresję guza nowotworowego u niektórych pacjentów po niezwiązanej z chorobą infekcji bakteryjnej, grzybiczej lub wirusowej. Jednak dopiero pod koniec lat 50. XX wieku zrozumiano rolę białych krwinek jako głównych strażników układu odpornościowego. Dziś, dzięki ogromnemu postępowi w dziedzinie genetyki i inżynierii komórkowej oraz zwiększonemu zrozumieniu funkcjonowania układu odpornościowego, terapia komórkowa oparta na limfocytach T stała się realną opcją leczenia dla pacjentów z nowotworami.

Obecnie możemy wyróżnić dwie główne podejścia w terapii opartej na limfocytach T. Pierwsze opiera się na obserwacji, że niektóre limfocyty, które penetrują nowotwór, wykazują reaktywność przeciwnowotworową. Te nacieki limfocytarne (z ang. tumor-infiltrating lymphocytes w skrócie TIL) są pobierane z miejsca guza za pomocą biopsji lub operacji, a następnie są namnażane w hodowlach komórkowych w laboratorium przed podaniem pacjentowi. Od pierwszego raportu z badań klinicznych nad TIL terapia ta została skutecznie stosowana u pacjentów z przerzutowym czerniakiem i innymi nowotworami litymi. Jednak pomimo pewnych unikalnych zalet, TILs napotykają szereg wyzwań, takich jak brak efektorowych limfocytów T o aktywności przeciwnowotworowej czy proces izolacji i namnażania w celu uzyskania wystarczającej liczby komórek do leczenia pacjentów. (Ryc. 1)

Obecnie podejmowane są większe wysiłki w celu rozwoju terapii opartej na receptorach antygenowych chimerycznych (z ang. chimeric antigen receptor w skrócie CAR). Nazwa ta odnosi się do genetycznie zmodyfikowanych receptorów powierzchniowych rozpoznających cząsteczki typowe dla komórek nowotworowych, które pobudzają limfocyty T do zabijania ich (Ryc.2). Limfocyty T są izolowane z krwi pacjenta, genetycznie modyfikowane w celu ekspresji receptorów CAR specyficznych dla nowotworu, następnie namnażane w dużej liczbie, a później ponownie wprowadzane do ciała tego samego pacjenta (Ryc.1). Dzięki temu, komórki CAR T mogą być skierowane przeciwko dowolnej cząsteczce na powierzchni komórek.

Krytyczny wybór antygenu nowotworowego

CAR-y mogą być zaprojektowane tak, aby rozpoznawać dowolny antygen na powierzchni komórek, jednak istnieje jeden podstawowy warunek. Aby opracować skuteczną terapię opartą na CAR, antygen musi być specyficzny wyłącznie dla komórek nowotworowych i nie może występować na powierzchni komórek zdrowych tkanek. W 2017 roku po raz pierwszy terapia CAR, która celuje w cząsteczki CD19 uwalniane  przez limfocyty B, została zatwierdzona przez FDA (Food and Drug Administration) w USA w celu leczenia pacjentów z nowotworami krwi. Fakt, że CD19 jest ograniczone wyłącznie do linii komórek B i że pacjenci mogą żyć bez komórek B, uczynił CD19 niezwykle obiecującym celem dla immunoterapii CAR opartej na limfocytach T. Do tej pory ponad 80% pacjentów z chłoniakiem, którzy byli oporni na pierwszą próbę leczenia, wykazało pozytywną reakcję po pojedynczych infuzjach CD19-CAR. Wystąpiła dwukrotnie większa liczba pacjentów z pełną odpowiedzią immunologiczną na ten antygen w porównaniu do pacjentów, którzy przeszli standardowe leczenie [2].

Jednak mimo, że uzyskano wiele znaczących wyników z zastosowaniem CAR w przypadku nowotworów krwi, ich skuteczność w leczeniu pacjentów z nowotworami litymi jest bardzo ograniczona. Jedną z przeszkód w terapii CAR T w przypadku nowotworów litych jest brak antygenów, które byłyby ograniczone tylko do guza, a tym samym konieczne jest uwzględnienie potencjalnej możliwości uszkodzenia zdrowych komórek (tzw. terapia ”on-target/off-tumor”).

Niestety, nawet identyfikacja celu specyficznego dla nowotworu nie zawsze gwarantuje skuteczne leczenie CAR. Na przykład w niektórych przypadkach pacjenci leczeni CD19-CAR, u których wystąpił nawrót choroby po leczeniu, rozwijali komórki nowotworowe o ujemnym występowaniu na powierzchni CD19 [4]. Ten fenomen został szeroko opisany jako “ucieczka antygenu”. Początkowo odkryty w nowotworach hematologicznych mechanizm oporności został zaobserwowany również w przypadku nowotworów litych. W celu rozwiązania problemu braku obecności jednego, specyficznego antygenu, CAR-y zostały zaprojektowane tak, aby jednocześnie atakować wiele antygenów.

Terapia On-target/off-tumor – możliwe skutki niepożądane

Antygeny nowotworowe w przypadku guzów litych często są wykrywane na zdrowych tkankach w różnych poziomach, co stwarza potencjalne ryzyko uszkodzenia zdrowych komórek przez CAR T, co świadczy o możliwości wystąpienia działań nieporządanych zastosowania terapii “on-target/off-tumor” (tłum. włącz cel/wyłącz nowotór). Jedną z najbardziej rewolucyjnych strategii rozróżnienia między tkanką nowotworową a zdrową jest zastosowanie tzw. bramek logicznych. Pionierskim wynalazkiem w tym zakresie było opracowanie tzw. układu synNotch, który działa w sposób „IF-THEN” (tłum. “jeśli-wtedy” rysunek 3A). W tym systemie rozpoznanie antygenu A przez syntetyczny receptor powoduje aktywację ekspresji CAR skierowanego przeciwko antygenowi B związanemu z nowotworem i w rezultacie aktywację limfocytów T. Ostatnio zespół z Uniwersytetu Stanford opracował platformę „AND” o nazwie LINK. W systemie LINK tylko jednoczesne oddziaływanie dwóch CAR skierowanych przeciwko różnym antygenom aktywuje limfocyty T (rysunek 3B).

Alternatywnie, obecnie naukowcy są w trakcie opracowywania bramki „AND-NOT”, w której jeden CAR rozpoznaje antygen związany z nowotworem, ale aktywacja limfocytów T może zostać zahamowana przez drugi CAR, który rozpoznaje antygen występujący tylko na powierzchni zdrowych komórek (rysunek 3C).

Toksykość związana z limfocytami T CAR

Istnieje określone terapeutyczne okno dla poziomu aktywacji limfocytów T CAR, aby było to klinicznie skuteczne. Tylko interakcje wiązania antygenu z CAR powyżej minimalnego progu indukują sygnał aktywacyjny w limfocytach T. Jeśli sygnał jest zbyt silny, komórki mogą ulec nadmiernej aktywacji, co doprowadzi do potencjalnej toksyczności terapii. Jednym z proponowanych sposobów kontroli toksyczności jest wprowadzenie tzw. przełączników eliminujących, które w przypadku ciężkiej toksyczności umożliwiają eliminację modyfikowanych komórek. Nie jest to idealne rozwiązanie, ponieważ podejście to wiąże się z całkowitą eliminacją podanej terapii u pacjenta, co oznacza potrzebę kolejnego podania.  Z tego powodu naukowcy wkłądają dużo wysiłku w rozwój regulowalnych platform CAR, które mogą służyć jako odwracalne “przełączniki bezpieczeństwa” i regulować sygnalizację CAR, bez konieczności eliminacji komórek. Modyfikowanie aktywności limfocytów T CAR poprzez podawanie pacjentom określonych leków daje nadzieję na poprawę bezpieczeństwa używania limfocytów T CAR i da możliwość powszechnego zastosowania niezależnie od wskazań chorobowych [3].

Wyzwania związane z produkcją limfocytów T CAR

Produkcja limfocytów T CAR na skalę kliniczną jest już sama w sobie trudna. Limfocyty T muszą być pobierane od pacjentów w specjalistycznych oddziałach w szpitalach. Następnie komórki są modyfikowane genetycznie w celu wyrażenia CAR za pomocą określonych bioreaktorów i namnażane w hodowlach komórkowych do bardzo dużej ilości. Indywidualna dawka dla pacjenta przechodzi rygorystyczne kontrole jakości i sterylności przed podaniem pacjentowi. Wszystkie te kroki generują ogromne koszty na pojedynczą dawkę dla pacjenta, zwłaszcza jeśli pacjenci wymagają wielokrotnego podania preparatu. Autologiczny charakter produktu limfocytów T CAR oznacza, że komórki macierzyste pochodzą od samego pacjenta i że każdy pacjent może być poddany infuzji CAR wyprodukowanych z jego/własnych limfocytów T. Wysoka specyficzność tej terapii dodatkowo ogranicza jej powszechne zastosowanie w leczeniu nowotworów. Z tego powodu różne laboratoria pracują nad opracowaniem sposobów poprawy siły antynowotworowej preparatów CAR w trakcie procesu produkcyjnego, poprzez dodawanie leków [5] lub zmianę składu mediów do hodowli komórkowej [6]. 

Inną możliwością jest terapia allogeniczna CAR. Ten podejście polega na wykorzystaniu limfocytów T od zdrowych dawców zamiast od pacjenta. Allogeniczne limfocyty T CAR mają przewagę gotowości do infuzji w momencie diagnozy. Niestety, allogeniczne limfocyty T CAR będą atakować normalne komórki pacjenta, powodując chorobę autoimmunologiczną przeciwko gospodarzowi (z ang. Graft-Versus-Host Disease w skrócie GVHD) i odrzut przeszczepionych komórek przez układ odpornościowy gospodarza [7]. Niektóre strategie mające na celu pokonanie GVHD obejmują zwiększenie immunosupresji gospodarza za pomocą konwencjonalnej chemioterapii przed infuzją preparatu, blokowanie cząsteczek biorących udział w rozpoznawaniu komórek dawcy lub podawanie przeciwciał immunosupresyjnych, których cele są edytowane z komórek uniwersalnych dawców. Wczesne dane odpowiedzi pacjentów nowotworowych na leczenie są obiecujące, ale długoterminowe bezpieczeństwo i skuteczność nie zostały jeszcze potwierdzone.

Finansowy aspekt limfocytów T CAR

Od czasu pierwszego zatwierdzenia w 2017 roku, rozwój limfocytów T CAR był prawie dziesięcioletnią podróżą, która stworzyła branżę wartą miliardy dolarów. Niestety, pomimo niesamowitego sukcesu, immunoterapia jest nieosiągalna dla wielu osób. Główną barierą w zastosowaniu tej terapii powszechnie jest wysoki koszt (275 000 EUR/312 500 USD) na pacjenta, potrzebna infrastruktura oraz wyspecjalizowany personel medyczny i naukowy przeprowadzający cały proces leczenia. Globalnie, Stany Zjednoczone i Chiny są liderami pod względem badań i zastosowania limfocytów T CAR, przy czym kilka terapii opartych na limfocytach T CAR wychodzi już poza zastosowanie w leczeniu nowotworów. W Europie kraje takie jak Polska i Rumunia pozostają w tyle za większymi państwami europejskimi np. za Hiszpanią, która jest liderem w terapii limfocytów T CAR opracowanej całkowicie w Europie. W Polsce limfocyty T CAR po raz pierwszy podano pacjentom w listopadzie 2019 roku, otwierając tym samym drzwi dla terapii komórek adoptywnych w Polsce [8].

Bibliografia:

1. Rosenberg, S.A., Packard, B.S., Aebersold, P.M., Solomon, D., Topalian, S.L., Toy, S.T., Simon, P., Lotze, M.T., Yang, J.C., Seipp, C.A., et al. (1988). Use of Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Interleukin-2 in the Immunotherapy of Patients with Metastatic Melanoma. New England Journal of Medicine 319, 1676-1680. 10.1056/nejm198812223192527.
2. Westin, J.R., Oluwole, O.O., Kersten, M.J., Miklos, D.B., Perales, M.-A., Ghobadi, A., Rapoport, A.P., Sureda, A., Jacobson, C.A., Farooq, U., et al. (2023). Survival with Axicabtagene Ciloleucel in Large B-Cell Lymphoma. New England Journal of Medicine. 10.1056/nejmoa2301665 PMID – 37272527.
3. Labanieh, L., Majzner, R.G., and Mackall, C.L. (2018). Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng 2, 377-391. 10.1038/s41551-018-0235-9 PMID – 31011197.
4. Majzner, R.G., and Mackall, C.L. (2018). Tumor Antigen Escape from CAR T-cell Therapy. Cancer Discov 8, 1219-1226. 10.1158/2159-8290.cd-18-0442 PMID – 30135176.
5. Weber, E.W., Parker, K.R., Sotillo, E., Lynn, R.C., Anbunathan, H., Lattin, J., Good, Z., Belk, J.A., Daniel, B., Klysz, D., et al. (2021). Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science 372, eaba1786. 10.1126/science.aba1786 PMID – 33795428.
6. Klysz, D., Carley, F., Meena, M., Lucille, S., Katherine, A.F., Stefanie, M., Bence, D., Katalin, S., Peng, X., Jing, H., et al. (2023). Inosine Induces Stemness Features in CAR T cells and Enhances Potency. bioRxiv, 2023.2004.2021.537859. 10.1101/2023.04.21.537859.
7. Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., and Benjamin, R. (2018). Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells 7, 155. 10.3390/cells7100155 PMID – 30275435.
8. Dytfeld, D., Łojko-Dankowska, A., Matuszak, M., Wache, A., Nowicki, A., Kozłowska-Skrzypczak, M., Bembnista, E., Matuszak, P., Kubiak, A., Jankowiak-Gracz, H., et al. (2020). Road to clinical implementation of CAR-T technology in Poznań. Acta Haematol Polonica 51, 24-28. 10.2478/ahp-2020-0006.

Dorota Klysz

Profil

Bio:

I am currently working as a senior process development scientist at the Stanford Center for Cancer Cell Therapy, where I am leading a project focusing on increasing CAR T cell anti-tumor function by modifying cell metabolism during manufacturing process either by changing culture media composition and/or by using cell engineering methods. This project spun-off from my postdoctoral research in Crystal L. Mackall lab at Stanford University, where I worked on making CAR T cells resistant to adenosine immunosuppression using genetic methods and small molecules. I gained my doctorate in immunology from University of Montpellier in France, where I trained with Naomi Taylor. My background is in biotechnology with master’s degree from the University of Agriculture in Cracow, Poland. I am an inventor on three patent applications and have co-authored 10 peer-reviewed articles.