Nowa, nagrodzona Nagrodą Nobla, metoda pozwala teraz dokładnie zrozumieć, co dzieje się wewnątrz wirusów, bakterii i komórek eukariotycznych. Umożliwia ona analizę komórki, bezpośrednio wizualizując jej wnętrze i znacznie ułatwiając zrozumienie, jak działa.
Aby zrozumieć żywy organizm, konieczne jest zrozumienie jego budulca, czyli komórek, oraz tego, jak komórki komunikują się ze sobą. Oceniając wewnętrzne funkcjonowanie pojedynczej komórki, trzeba zrozumieć struktury jej składników, takich jak białka, kwasy nukleinowe, lipidy i węglowodany, oraz mechanizmy biochemiczne, które wykorzystywane są do funkcji. Podobnie, gdy obserwujemy samochód z pięćdziesiątego piętra wieżowca, nie jesteśmy w stanie wiele o nim powiedzieć. Następnie, z pierwszego piętra, można rozpoznać model pojazdu i kilka głównych szczegółów. Ale dopiero gdy otworzysz maskę i spojrzysz na silnik, będziesz w stanie docenić śruby i nakrętki pojazdu i dowiedzieć się, jak działa samochód.
Teraz wyobraź sobie, że możesz zastosować podobną logikę w prawdziwym życiu, aby zrozumieć, co dokładnie dzieje się wewnątrz wirusów, bakterii i komórek eukariotycznych. Prezentowana metoda zwana mikroskopią krioelektronową, lub w skrócie cryo-EM, pozwala na dogłębne przeanalizowanie wnętrza komórek. Jednocząsteczkowa cryo-EM pozwala na określanie struktury makrocząsteczek wyizolowanych z komórek z rozdzielczością bliską atomowej lub atomową, podczas gdy jej siostrzana metoda, tomografia krioelektronowa (zwana również cryo-ET) umożliwia oglądanie makrocząsteczek wewnątrz komórki, choć z nieco mniejszą rozdzielczością. Łącznie, metoda cryo-EM pozwala na wejście do komórki i bezpośrednią wizualizację jej wnętrza.
Analiza pojedynczej cząsteczki metodą cryo-EM polega na szybkim zamrożeniu badanych cząsteczek w stanie w pełni uwodnionym w temperaturze około -180 stopni Celsjusza, a następnie obrazowaniu tych cząsteczek wiązką wysokoenergetycznych elektronów. Powodem, dla którego takie podejście jest ważne jest to, że pozwala naukowcom zobaczyć jak wyglądają cząsteczki i jak oddziałują ze sobą w ich naturalnym stanie. Wcześniej było to niemożliwe, ponieważ makrocząsteczki są często zbyt duże lub zbyt dynamiczne dla innych metod obrazowania. Na przykład, jeśli kompleks wielkocząsteczkowy nie jest jednorodny lub wystarczająco sztywny, aby utworzyć kryształ, nie można go obrazować za pomocą promieniowania rentgenowskiego. W tym przypadku cryo-EM naprawdę zrewolucjonizowała dziedzinę biologii strukturalnej.
Dlaczego metoda cryo-EM wykracza poza jakąkolwiek konkretną dziedzinę i zmienia kierunek rozwoju nauk biologicznych? Po pierwsze, ma ogromne znaczenie dla nauk podstawowych, ponieważ pozwala na wizualizację cząsteczek i procesów, które do tej pory były niewidoczne, lub na ponowne przyjrzenie się zjawiskom pozornie już zrozumianym, ale bardziej szczegółowo. Wysokorozdzielcze struktury cryo-EM 3D rzuciły już światło na mnóstwo procesów komórkowych, począwszy od replikacji i transkrypcji DNA, poprzez syntezę i degradację białek, wymianę wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową, aż po interakcje z udziałem różnych receptorów błonowych z ich ligandami czy wirusami. Ten ostatni fakt podkreśla ogromny potencjał metody cryo-EM w rozwoju leków, ponieważ wgląd w struktury makrocząsteczek niezbędnych w medycynie jest możliwy, a co ważne mogą one być bezpośrednio wykorzystane do racjonalnego projektowania leków. Na przykład, niedawno rozwiązane struktury krio-EM białek kolcowych SARS-CoV-2 i ich kompleksów z ludzkimi receptorami i przeciwciałami neutralizującymi pomogły ułatwić opracowanie leków i szczepionek przeciwko COVID-19.
Profesor Arek Kulczyk jest naukowcem pracującym w dziedzinie cryo-EM. Arek i członkowie jego laboratorium z Harvard Medical School i Rutgers University są zaangażowani w rozwój nowych metod krio-EM oraz zastosowanie tych metod do określania struktury biomolekuł ważnych z medycznego punktu widzenia. Jego laboratorium integruje metody strukturalne, w tym krioEM, krioET i korelacyjną mikroskopię świetlną i elektronową (CLEM) w celu badania replikacji DNA w ludzkich mitochondriach, interakcji rybosomów z toksynami bakteryjnymi oraz kompleksów wielobiałkowych zaangażowanych w tworzenie błon podstawnych, które sklejają komórki i tkanki. Dzięki swoim badaniom Arek spodziewa się odkryć informacje, które mogą ułatwić opracowanie nowych terapii w leczeniu zaburzeń neurodegeneracyjnych, toksyn bakteryjnych i nowotworów.
Jedna ze struktur wyznaczonych ostatnio przez grupę Arka jest przedstawiona na rysunku. Rysunek przedstawia widok wycinka struktury wysokiej rozdzielczości wirusa (AAV), który jest szeroko stosowanym wektorem do terapii genowej. Struktura AAV pokazuje szereg dobrze zdefiniowanych zagęszczeń EM reprezentujących różne elementy struktury drugorzędowej i poszczególne aminokwasy, które budują i stabilizują cząsteczkę wirusową.
Więcej informacji na temat cryo-EM i badań prof. Kulczyka można znaleźć na stronie http://kulczyk-lab.cryoemcorp.com/ lub pisząc na adres arek.kulczyk@rutgers.edu
Arek Kulczyk – profesor Biochemii na Rutgers University w New Jersey ((http://kulczyk-lab.cryoemcorp.com) oraz Prezes i Założyciel cryo-EMcorp (http://consulting.cryoemcorp.com), firmy konsultingowej oraz światowego lidera w doradztwie w zakresie cryo-EM. Arek ukończył studia magisterskiej na Uniwersytecie Jagiellońskim w Polsce, a także doktorat na University of Cambridge w Wielkiej Brytanii. W laboratorium biologii molekularnej pracował nad określeniem struktury NMR domen cynkowo-pierścieniowych z DLC i PARP-1, dwóch ważnych z medycznego punktu widzenia białek zaangażowanych w naprawę przez wycięcie zasad w ludzkim DNA. Po uzyskaniu stopnia doktora Arek przeniósł się do Bostonu i rozpoczął studia podoktorskie na Harvardzie. Na Harvardzie opracował nowatorskie techniki jednocząsteczkowe do monitorowania aktywności enzymatycznej białek replikacyjnych. Po zakończeniu szkolenia podoktorskiego, a przed przyjęciem profesury w Rutgers, Arek został młodszym wykładowcą w Harvard Medical School, gdzie określił strukturę krio-EM repliksomu bakteriofaga T7. Struktura ta dostarczyła pierwszego szczegółowego obrazu całego repliksomu i ujawniła fundamentalne mechanizmy molekularne dla koordynacji syntezy pasma wiodącego i opóźnionego.
